外周血PBMNC分離及凍存

PBMNC分離效果

按照GMP生產(chǎn)規(guī)范和臨床ACI要求分離外周血PBMNC，冷凍保存前細(xì)胞活性為99.6%±0.4%（n=5），與原始血樣比，PBMNC回收率58.4%±6.52%（n=5）。

細(xì)菌和真菌培養(yǎng)陰性，實(shí)現(xiàn)全程無菌處理。

不同冷凍保護(hù)液對(duì)PBMNC的保護(hù)效果不同

PBMNC在－196℃液氮中儲(chǔ)存24個(gè)月后復(fù)蘇，鏡下觀察見細(xì)胞形態(tài)完整，圓形飽滿，PBMNC復(fù)蘇效率89.7%±3.82%，凍存液中含80%無血清培養(yǎng)基組和含80%自體血漿組比較，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P≥0.05）（表1）。

PBMNC凍存后誘導(dǎo)

AIL細(xì)胞的體外增殖及表型分析在倒置顯微鏡下觀察顯示，外周血單個(gè)核細(xì)胞呈懸浮生長(zhǎng)，大小均勻，折光性一致，AIL經(jīng)4d培養(yǎng)后部分細(xì)胞明顯增大，可見細(xì)胞集落，胞核密度加強(qiáng)，體積增大，胞膜光滑，未見突起，新鮮與凍存后的單個(gè)核細(xì)胞誘導(dǎo)的AIL在形態(tài)和表型上無明顯差別，增殖高峰期均在10－12d。

在培養(yǎng)過程中第14天，凍存組AIL細(xì)胞所占相對(duì)百分率由約2.3%上升約為10.4%，細(xì)胞數(shù)增加約1048倍，對(duì)照組AIL所占相對(duì)百分率由約2.3%上升為約11.3%，細(xì)胞數(shù)增加約1105倍。兩組之間在細(xì)胞增長(zhǎng)倍數(shù)與AIL所占百分比無顯著差異（P＞0.05）。

（表1）

效應(yīng)細(xì)胞的體外細(xì)胞毒活性

新鮮的與凍存的單個(gè)核細(xì)胞誘導(dǎo)的AIL對(duì)NK敏感（K562）或非敏感株細(xì)胞（HeLa）及貼壁或懸浮生長(zhǎng)的腫瘤細(xì)胞均顯示出很強(qiáng)的殺傷活性，且該活性隨效靶濃度比的增加而增大，兩組間的細(xì)胞毒活性無顯著性差異（P＞0.05）（表2）。

圖2：比較各種冷凍和對(duì)照組之間的增殖和細(xì)胞表型。A：所有表型培養(yǎng)前。B：所有在冷凍組表型培養(yǎng)14 天后。C：所有對(duì)照組表型培養(yǎng)14 天后，D：所有增殖。E：自體免疫淋巴細(xì)胞。