液氮超低溫凍結法詳細操作步驟

液氮超低溫保藏技術是將菌種保藏在-196℃的液態氮，或在-150℃的氮氣中的長期保藏方法，它的原理是利用微生物在-130℃以下新陳代謝趨于停止而有效地保藏微生物。

操作步驟如下：

1、安瓿管或凍存管的準備

用圓底硼硅玻璃制品的安瓿管，或螺旋口的塑料凍存管。注意玻璃管不能有裂紋。將凍存管或安瓿管清洗干凈， 121℃下高壓滅菌15-20分鐘，備用。

2、保護劑的準備

保護劑種類要根據微生物類別選擇。配制保護劑時，應注意其濃度，一般采用10-20%甘油。

3、微生物保藏物的準備

微生物不同的生理狀態對存活率有影響，一般使用靜止期或成熟期培養物。

分裝時注意應在無菌條件下操作。

菌種的準備可采用下列幾種方法： 刮取培養物斜面上的孢子或菌體，與保護劑混勻后加入凍存管內;

接種液體培養基，振蕩培養后取菌懸液與保護劑混合分裝于凍存管內;

將培養物在平皿培養，形成菌落后，用無菌打孔器從平板上切取一些大小均勻的小塊(直徑約5-10毫米)，真菌取菌落邊緣的菌塊，與保護劑混勻后加入凍存管內;

在小安瓿管中裝1.2-2毫升的瓊脂培養基，接種菌種，培養2-10天后，加入保護劑，待保藏。

4、預凍

預凍時一般冷凍速度控制在以每分鐘下降1℃為好、使樣品凍結到-35℃。

目前常用的有三種控溫方法：

—— 程序控溫降溫法，應用電子計算機程序控制降溫裝置，可以穩定連續降溫，能很好地控制降溫速率。

—— 分段降溫法：將菌體在不同溫級的冰箱或液氮罐口分段降溫冷卻，或懸掛于冰的氣霧中逐漸降溫。一般采用二步控溫，將安瓿管或塑料小管，先放-20℃至-40℃冰箱中1-2小時，然后取出放入液氮罐中快速冷凍。這樣冷凍速率大約每分鐘下降1-1.5℃。

—— 對耐低溫的微生物、可以直接放入氣相或液相氮中。

5、保藏

將安瓿管或塑料凍存管置于液氮罐中保藏。一般氣相中溫度為-150℃，液相中溫度為-196℃。

6、復蘇方法

從液氮罐中取出安瓿管或塑料凍存管，應立即放置在38℃-40℃水浴中快速復蘇并適當搖動。直到內部結冰全部溶解為止，一般約需50秒-100秒。開啟安瓿管或塑料凍存管，將內容物移至適宜的培養基上進行培養。