液氮超低溫保藏菌種程序

　　1、容器的選擇：使用帶螺旋蓋的2ml塑料安培瓶。液氦杜瓦

　　2、檢查安培瓶是否滲漏：用0.05%的亞甲基藍(lán)水溶液在4℃浸泡30-45分鐘，沖洗干凈，棄去含有藍(lán)色染料的安培瓶，其余的安培瓶備用。

　　3、打印標(biāo)簽(激光打印)。

　　4、容器的滅菌：先用蒸餾水漂洗干凈安培瓶，再用蒸餾水在滅菌鍋中121℃浸泡滅菌15分鐘，干燥并將打印好的標(biāo)簽放入安培瓶中，略擰緊螺旋蓋，再行121℃滅菌30分鐘。液氦杜瓦

　　5、保藏菌菌齡：處于**生長量階段或?qū)?shù)生長期后期。

　　6、保護(hù)劑：選用5-10%的甘油或二甲基亞砜作保護(hù)劑。

　　1)甘油的準(zhǔn)備：在121℃滅菌15分鐘，2-8℃貯存。甘油一般以兩倍*終所需濃度的水溶液保存，然后與同等量的細(xì)胞懸液混合。若不用細(xì)胞懸液，則以*終所需濃度的水溶液保存。

　　2)二甲基亞砜：用0.22um的聚四氟乙烯過濾膜過濾除菌。過濾膜預(yù)先用甲醇和二甲基亞砜漂洗。無菌的二甲基亞砜以10-15ml裝量2-8℃避光保存。

　　7、分裝：在無菌條件下，將細(xì)胞懸液(從平板上打下直徑為5cm的菌塊)分裝于安培瓶中，并注入保護(hù)劑，擰緊螺旋蓋。

　　8、將安培瓶固定在鋁夾上，貼好標(biāo)簽。為了便于取用，一般一個(gè)鋁夾上僅放一個(gè)菌株。

　　9、將控溫系統(tǒng)先預(yù)冷到4℃，再將鋁夾放入其中。以每分鐘1℃降溫至-40℃，然后以每分鐘10℃降溫至-90℃。降溫以后，將鋁夾轉(zhuǎn)移至處于液氮中的儲存器中保存。

　　10、菌種的復(fù)活：將液氮保藏的菌種取出，迅速放入37℃水浴中解凍。一般需2至2.5分鐘,等解凍后，再及時(shí)轉(zhuǎn)接到合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。